服務(wù)內(nèi)容

? 交付內(nèi)容：高表達(dá)單克隆細(xì)胞株（1×10⁷cells/ml,1ml）或 cell pool（1×10⁷cells/ml,1ml）；克隆載體；質(zhì)檢報(bào)告；實(shí)驗(yàn)流程報(bào)告；

? 周期：cell pool，8周；單克隆細(xì)胞株，12周

穩(wěn)定細(xì)胞系篩選流程

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

      提前兩周準(zhǔn)備CHO細(xì)胞，保證細(xì)胞處于高活力和良好的狀態(tài)

2. 質(zhì)粒構(gòu)建

      您提供序列，我們進(jìn)行密碼子優(yōu)化，基因合成，構(gòu)建質(zhì)粒。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之前，我們會(huì)先瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)評(píng)估。

3. 轉(zhuǎn)染

      電轉(zhuǎn)，提前準(zhǔn)備細(xì)胞，質(zhì)粒，和確定轉(zhuǎn)染條件。
      電穿孔轉(zhuǎn)染原理：通過電場(chǎng)作用，在細(xì)胞膜上暫時(shí)形成小孔或開口，把大分子如DNA等導(dǎo)入細(xì)胞并最終進(jìn)入細(xì)胞核中。在電擊過程中，細(xì)胞膜上出現(xiàn)穿孔，質(zhì)粒在電泳力的作用下與細(xì)胞膜接觸，并與細(xì)胞膜上電穿孔區(qū)域形成一種可轉(zhuǎn)移的復(fù)合物。再次電擊后，質(zhì)粒脫離復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，開始瞬轉(zhuǎn)，同時(shí)小部分質(zhì)粒進(jìn)入核內(nèi)與染色體整合，開始穩(wěn)轉(zhuǎn)。DNA進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞膜上的小孔可自動(dòng)重新閉合。

4. Cell pool篩選

      轉(zhuǎn)染48小時(shí)之后，使用篩選培養(yǎng)基進(jìn)行cell pool的篩選。培養(yǎng)，并挑選高表達(dá)的cell pool，放大培養(yǎng)，凍存高表達(dá)的cell pool。

5. 加壓篩選單克隆

      挑選最高表達(dá)的cell pool，有限稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，鋪板密度為0.5-1 cell/well，鋪板15天后，顯微鏡觀察，標(biāo)記單克隆，挑選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行批培養(yǎng)和穩(wěn)定性檢測(cè)。

      我們選用GS系統(tǒng)，MSX篩選，逐漸提高藥物的濃度，進(jìn)行多輪次的壓力篩選，以提高基因的表達(dá)水平。

6. 表達(dá)量評(píng)估

      將96孔板細(xì)胞擴(kuò)增至六孔板，按4×10⁵cells 接種，一周后收集上清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估表達(dá)量，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，挑選10個(gè)最高表達(dá)的克隆進(jìn)行批培養(yǎng)和穩(wěn)定性測(cè)試。

7. 批培養(yǎng)&穩(wěn)定性測(cè)試

      相同密度細(xì)胞接種到搖瓶，每天取樣計(jì)數(shù)，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確認(rèn)生長(zhǎng)和表達(dá)曲線。相同密度的細(xì)胞接種到搖瓶，每隔48小時(shí)，取樣計(jì)數(shù)，按照相同的密度繼續(xù)接種，最后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確認(rèn)細(xì)胞表達(dá)穩(wěn)定性。穩(wěn)定性測(cè)試進(jìn)行50代。