CRISPR基因編輯技術(shù)是繼TALEN基因編輯技術(shù)之后又一重大突破。CRISPR系統(tǒng)的基因編輯效率更高，載體構(gòu)建與使用也更加便捷，并已應(yīng)用在各物種中，是目前使用廣泛的基因編輯技術(shù)。
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細(xì)胞內(nèi)基因組DNA在被CRISP對Cas9復(fù)合體(含Cas9和sgRNA)特異識別后，Cas9核酸內(nèi)切酶特異切割目標(biāo)基因組DNA雙鏈，產(chǎn)生DSB損傷，從而誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機(jī)制。其中的NHEJ修復(fù)是一種易錯修復(fù)，在修復(fù)過程中會隨機(jī)引入或刪除核苷酸對，導(dǎo)致目標(biāo)基因內(nèi)核苷酸對的刪除或插入(indel)，從而形成移碼突變，造成目標(biāo)基因的突變、實(shí)現(xiàn)基因敲除。而如果在編碼基因的目標(biāo)外顯子的5'側(cè)翼和3'側(cè)翼分別設(shè)計一個sgRNA,則可以實(shí)現(xiàn)刪除目標(biāo)基因內(nèi)片段式的基因敲除。
通過在非micro RNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)5'側(cè)翼和3'側(cè)翼游處分別設(shè)計一個sgRNA,可以刪除發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)片段，從而實(shí)現(xiàn)對micro RIVA的敲除。而如果micro RNA成熟片段內(nèi)含有sgRNA識別序列、則可以直接實(shí)現(xiàn)刪除或插入式的基因敲除。同樣地，運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對incRNA等的基因敲除。
Cas9切割目標(biāo)基因DNA雙鏈產(chǎn)生DSB損傷還誘發(fā)細(xì)胞啟動同源重組修復(fù)。此時，若能提供同源修復(fù)模板供體、而此供體亦已引入如點(diǎn)突變、保守區(qū)域替換或加入標(biāo)簽編碼序列(如GFP、F,lag、HA)等、則研究者可實(shí)現(xiàn)在基因組特定位置的基因敲入。
Cas9 含有兩個酶切活性位點(diǎn),每一個位點(diǎn)負(fù)責(zé)切割 DNA 雙螺旋中的一條鏈。如果把兩個活性位點(diǎn)均突變掉,則該Cas9不在具備核酸內(nèi)切酶活性, 不過, 它仍能通過 sgRNA 結(jié)合在目標(biāo)基因的啟動子上。
如果在雙突變的Cas9(dCas9)的C端加上VP16等具激活性的功能結(jié)構(gòu)域, 則可以特異地激活目標(biāo)基因的表達(dá)。如果在雙突變的 Cas9(dCas9)的C端加上EVE等抑制活性的功能結(jié)構(gòu)域,則可以特異地抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。
通過cas9在待突變位點(diǎn)附近引入雙鏈DNA斷裂，使用帶突變序列的DNA作為供體序列，通過同源重組的方式替代野生型位點(diǎn)，以造成定點(diǎn)突變。
1. 效率高：可精確編輯基因組，編輯效率高
2. 周期短：構(gòu)建和使用極為方便，極大降低了實(shí)驗(yàn)難度，縮短實(shí)驗(yàn)周期
3. 廣譜性：無基因、細(xì)胞及物種限制
4. 多重編輯能力：可實(shí)現(xiàn)多個靶位點(diǎn)同時進(jìn)行基因打靶
5. 功能豐富：可實(shí)現(xiàn)敲除、插入、抑制、激活等多種目的基因
